В отличие от серологических методов диагностики ВГС, где обнаруживают антитела к ВГС, ПЦР позволяет установить наличие непосредственно РНК ВГС и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность — 10 молекул РНК ВГС в исследуемом материале достаточно для его выявления. Обнаружение антител к вирусу гепатита С подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса), о прогнозе заболевания. Кроме того, антитела к вирусу гепатита С обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом, так и у тех пациентов, кто болел и выздоровел, а нередко антитела в крови находят только спустя несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику.
Обнаружение вируса гепатита С в крови с использованием ПЦР — более информативный метод диагностики. Выявление ПЦР РНК вируса гепатита С свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и является одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК вируса гепатита С с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия какихлибо серологических маркеров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК вируса гепатита С на фоне полного отсутствия какихлибо других серологических маркеров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР. В таких случаях требуются всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований и повторное неоднократное подтверждение наличия инфекции ПЦР.
Важное значение имеет метод ПЦР у больных хроническим вирусным гепатитом С, так как у большинства из них отсутствует корреляция между наличием вирусной репликации и активностью печеночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражается количественно. В большинстве случаев исчезновение из сыворотки крови РНК вируса гепатита С наблюдается позже нормализации содержания печеночных ферментов, поэтому их нормализация — не основание для прекращения противовирусного лечения.
Практически важно для выявления РНК вируса исследовать методом ПЦР не только сыворотку крови, но и лимфоциты, гепатобиоптаты. Вирусы удается обнаружить в 2—3 раза чаще в ткани печени, чем в сыворотке крови [Серов Н.А и др., 1998].
При оценке результатов исследования сыворотки крови на РНК вируса гепатита С следует помнить, что виремия может быть флюктуирующей (как и изменения активности ферментов). Поэтому после положительных результатов исследования ПЦР можно получить отрицательный результат и наоборот. В таких случаях для разрешения возникающих сомнений лучше исследовать гепатобиоптаты.
Обнаружение РНК вируса гепатита С в материале с помощью ПЦР необходимо для:
разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
дифференциации гепатита С от других форм гепатита;
выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом; определения стадии инфицированности новорожденных от серопозитив ных по вирусу гепатита С матерей;
контроля эффективности противовирусного лечения.
Все вышеизложенные особенности оценки результатов и подходов к диагностике вируса гепатита С с помощью ПЦР относятся и к другим инфекциям.
Обнаружение вируса гепатита В Вирус гепатита В в материале в норме отсутствует.
ПЦР позволяет определять в исследуемом материале (кровь, пунктат печени) ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Качественное определение вируса гепатита В в материале подтверждает наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает патогенез заболевания.
Количественный метод определения содержания ДНК вируса гепатита В в исследуемом материале дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к антивирусным препаратам. Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови в настоящее время применяют тестсистемы, чувствительность которых составляет 50—100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5Ю3—104 мл [Барановский П.М. и др., 1998]. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50 % больных при отсутствии HBeAg.
Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови, лимфоциты, гепатобиоптаты. Оценка результатов исследования на ДНК вирусного гепатита В во многом аналогична описанному для гепатита С.
Обнаружение ДНК вируса гепатита В в материале с помощью ПЦР необходимо для:
разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
выявления острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом;
контроля эффективности противовирусного лечения.
Обнаружение вируса иммунодефицита человека Вирус иммунодефицита человека в материале в норме отсутствует.
Метод ПЦР для обнаружения РНК ВИЧ может быть качественным и количественным.
Качественное обнаружение РНК вируса иммунодефицита человека с помощью ПЦР используют для:
неонатального скрининга;
подтверждения результатов скринингового серологического исследования;
скрининга пациентов с высоким риском;
разрешения сомнительных результатов по иммуноблотинговому исследованию;
контроля эффективности противовирусного лечения;
определения стадии заболевания СПИД (переход инфицированности в заболевание).
Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение содержания СО4+клеток, предсказать скорость развития СПИД у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно, более точно оценить их выживаемость.
Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием СО4+клеток. Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием СО4+клеток. Содержание вирусной РНК в крови позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. При содержании РНК1 ВИЧ >74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИД [Senior D., Holden E., 1996]. Вероятность развития СПИД в 10,8 раза больше у лиц с содержанием ВИЧ1 в крови >10 000 копий/мл, чем улиц с содержанием ВИЧ в крови <10 000 копий/мл. При инфекции ВИЧ прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.
Обнаружение цитомегаловируса Цитомегаловирус в исследуемом материале в норме отсутствует.
Обнаружение частиц вируса в крови больного с помощью ПЦР используют для диагностики цитомегаловирусной инфекции и контроля эффективности противовирусного лечения. В отличие от серологических методов диагностики цитомегаловирусной инфекции, где выявляют антитела к ЦМВ, ПЦР позволяет установить наличие непосредственно ЦМВ и количественно выразить его концентрацию в сыворотке крови. Выявление ЦМВ имеет большое значение в диагностике перинатальной патологии. Внутриутробная и перинатальная передача ЦМВ может иметь тяжелые последствия. Цитомегаловирусная инфекция во время беременности часто протекает в субклинической форме и сопровождается невыраженными симптомами. ПЦР в таких случаях позволяет выявить этиологический фактор заболевания. Материалом для исследования могут служить клетки осадка мочи (новорожденных детей), эпителий цервикального канала больных женщин, околоплодные воды, соскобы с конъюнктивы глаз и урогенитального тракта, слюна, пунктаты печени.
Обнаружение вируса папилломы человека Вирусы папилломы человека (human papillomavirus — HPV) являются малыми ДНКсодержащими онкогенными вирусами, которые инфицируют эпителиальные клетки и индуцируют пролиферативные поражения. В настоящее время выделено более типов вируса папилломы человека. Эпидемиологический анализ данных исследований на наличие вируса папилломы человека позволил выдвинуть концепцию об участии вирусов этой группы в развитии эпителиальных злокачественных новообразований.
Более 90 % всех цервикальных карцином позитивны на присутствие вирусов папилломы человека. Наиболее часто в материале из опухолей шейки матки обнаруживают типы 16 и 18 вирусов [Gabbot M. et al., 1997].
Вирусы папилломы человека типа 6 и 11 признаны этиологическим началом рецидивирующего респираторного папилломатоза, который обычно поражает носоглотку, трахею, гортань, может прогрессировать и стать распространенным бронхопульмональным заболеванием. В большинстве случаев папилломатоз является доброкачественным, однако может трансформироваться в плоскоклеточную карциному [Rady P.L. et al., 1997].
ДНК HPV типа 16 часто выявляют в клетках уротелиальной карциномы при раке мочевого пузыря у пациентов с иммунодефицитом [Beltran L.A., Escudero A.L., 1997].
Единственным методом обнаружения вирусов папилломы человека при перечисленных заболеваниях является метод ПЦР. Материалом для исследования служат пунктаты опухолей, лимфатических узлов, отделяемое из влагалища, носа, трахеи, моча.
Обнаружение в исследуемом материале вируса папилломы человека определенного типа еще не говорит о наличии у пациента злокачественной опухоли, но требует проведения гистологического исследования субстрата болезни и последующего динамического наблюдения за ним.
Высказывается мнение о важной роли обнаружения вирусов папилломы человека в биоптатах лимфатических узлов при цервикальной карциноме, для определения объема оперативного лечения и выявления интактных и пораженных метастазами лимфатических узлов. При нахождении вирусов папилломы человека в лимфатических узлах, даже при отсутствии гистологических признаков их опухолевого поражения, результаты исследования необходимо расценивать как наличие метастазов в лимфатические узлы [Sopy Т. et al., 1997].
Обнаружение микобактерий туберкулеза Микобактерий туберкулеза в материале в норме отсутствуют.
В отличие от серологических методов диагностики туберкулезной инфекции, где находят антитела к микобактериям туберкулеза, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно ДНК микобактерий туберкулеза и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материале. Исследуемым материалом могут быть мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, моча, пунктаты из различных органов и кист и др. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность (более 95 %).
Микробиологическая диагностика туберкулеза в настоящее время — основной метод выявления больных и мониторинга эффективности лечения. Однако микробиологические анализы на туберкулез чрезвычайно продолжительны и имеют низкую чувствительность (выявление положительных проб не превышает 50 %).
Диагностика туберкулеза ПЦР имеет большое диагностическое значение (время исследования 4—5 ч). В исследованиях В.И. Голышевской и соавт. (1998) показано, что результаты ПЦР в 100 % случаев совпадали с положительными результатами микроскопии и бактериологического посева и свидетельствовали о наличии ДНК микобактерий в 65 % случаев у больных туберкулезом с отрицательным результатом микроскопии и посева. Обнаружение ДНК микобактерий туберкулеза в материале с помощью ПЦР необходимо для:
Вместе с тем следует отметить, что ПЦР для диагностики туберкулеза не заменяет бактериологических методов.
Обнаружение Helicobacter pylori Helicobacter pylori в исследуемом материале в норме отсутствует.
Helicobacter pylori отводится ведущая роль в этиологии хронического гастрита, язвенной болезни, рака желудка. Колонизация эпителия слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки Helicobacter pylori является одним из основных факторов возникновения хронического воспаления, называемого гастритом типа В.
